Bộ xét nghiệm Anti Thyroid Peroxidase Elisa Bộ xét nghiệm kháng thể kháng TPO

Bộ công cụ kháng giáp Peroxidase Elisa Anti-TPO

1. Mục đích sử dụng

Xét nghiệm miễn dịch để xác định định lượng trong ống nghiệm các kháng thể kháng peroxidase tuyến giáp trong huyết thanh người.Việc xác định kháng TPO được sử dụng để hỗ trợ chẩn đoán các bệnh tuyến giáp tự miễn.

2. Tóm tắt 

• Peroxidase đặc hiệu tuyến giáp (TPO) hiện diện trên các microsome của tế bào tuyến giáp và được biểu hiện ở bề mặt tế bào đỉnh của nó.Khi phối hợp với thyroglobulin (Tg), enzym này có chức năng thiết yếu trong quá trình i-ốt hóa L ‐ tyrosine và kết hợp hóa học của mono‐ và di ‐ iodotyrosine tạo thành các hormone tuyến giáp T4, T3 và fT3.
• TPO là một autoantigen tiềm năng.Hiệu giá huyết thanh tăng cao của các kháng thể đối với TPO được tìm thấy trong một số dạng viêm tuyến giáp do tự miễn dịch.Thuật ngữ vẫn thường được tìm thấy “kháng thể microomal” bắt nguồn từ thời điểm TPO vẫn chưa được xác định là một kháng nguyên trong quá trình tự miễn dịch do microsome gây ra.Theo nghĩa lâm sàng, hai thuật ngữ kháng TPO và kháng thể microomal có thể được sử dụng đồng nghĩa;Tuy nhiên, có sự khác biệt đối với các phương pháp thử nghiệm.
• Hiệu giá kháng TPO cao được tìm thấy ở 90% bệnh nhân bị viêm tuyến giáp Hashimoto mãn tính.Trong bệnh Graves, 70% bệnh nhân có hiệu giá cao.Mặc dù độ nhạy của quy trình có thể được tăng lên bằng cách xác định đồng thời các kháng thể tuyến giáp khác (kháng thể kháng Tg, kháng thể thụ thể TSH - TRAb), kết quả âm tính không loại trừ khả năng mắc bệnh tự miễn.Độ lớn của hiệu giá kháng thể không tương quan với hoạt động lâm sàng của bệnh.Hiệu giá ban đầu tăng cao có thể trở nên tiêu cực sau thời gian dài của bệnh hoặc trong thời gian thuyên giảm.Nếu kháng thể xuất hiện trở lại sau khi thuyên giảm, thì có thể tái phát.
• Trong khi các xét nghiệm kháng thể microomal thông thường sử dụng các microsome chưa được tinh chế làm chuẩn bị kháng nguyên, thì các xét nghiệm kháng TPO sử dụng peroxidase tinh khiết.Hai quy trình có hiệu suất tương đương nhau về độ nhạy lâm sàng, nhưng có thể mong đợi tính nhất quán của lô với lô tốt hơn và độ đặc hiệu lâm sàng cao hơn từ các xét nghiệm kháng TPO do chất lượng kháng nguyên được sử dụng cao hơn.Các xét nghiệm hấp thụ miễn dịch liên kết với Enzyme sử dụng kháng nguyên của con người và kháng thể kháng IgG của thỏ (anti-IgG) ở thỏ.

3. Nguyên tắc kiểm tra

Phương pháp gián tiếp, tổng thời gian khảo nghiệm: 70 phút.

ELISA Anti-TPO sử dụng pha rắn, phương pháp ELISA gián tiếp để phát hiện các kháng thể với TPO trong quy trình ủ hai bước.Các dải microwell polystyrene được phủ sẵn các kháng nguyên TPO của con người có hoạt tính miễn dịch cao.Trong bước ủ bệnh đầu tiên, các kháng thể đặc hiệu chống TPO, nếu có, sẽ liên kết với các kháng nguyên TPO được phủ trước ở pha rắn.Các giếng được rửa để loại bỏ các protein huyết thanh không liên kết và các kháng thể IgG kháng người (anti-IgG) của thỏ được kết hợp với enzyme peroxidase củ cải ngựa (HRP- Conjugate) được thêm vào.Trong bước ủ thứ hai, các kháng thể liên hợp HRP này sẽ được liên kết với bất kỳ phức hợp kháng nguyên-kháng thể (IgG) nào đã hình thành trước đó và phức hợp HRP chưa liên kết sau đó được loại bỏ bằng cách rửa.Các dung dịch chromogen có chứa Tetramethylbenzidine (TMB) và urê peroxide được thêm vào giếng và với sự hiện diện của chất tổng hợp miễn dịch kháng nguyên-kháng thể-kháng IgG (HRP), các Chromogens không màu bị thủy phân bởi liên hợp HRP liên kết thành sản phẩm có màu xanh lam.Từ màu xanh lam chuyển sang màu vàng sau khi dừng phản ứng với axit sunfuric.

Lượng cường độ màu có thể được đo và nó tỷ lệ với lượng kháng thể được bắt giữ trong các giếng và với lượng kháng thể trong mẫu tương ứng.

4. Vật liệu thử được cung cấp

• Microplate tráng, 8 x 12 dải, 96 giếng.Được phủ sẵn kháng nguyên TPO của người.

• Dụng cụ hiệu chuẩn, 6 lọ, mỗi lọ 1 mL, sẵn sàng sử dụng;Nồng độ: 0 (A), 25 (B), 50 (C), 100 (D), 250 (E) và 500 (F) IU / mL.

• Enzyme Conjugate, 1 lọ, 11,0 mL HRP (peroxidase củ cải ngựa) đánh dấu kháng thể IgG kháng IgG của thỏ (anti-IgG) trong đệm Tris-NaCl có chứa BSA (albumin huyết thanh bò).Chứa 0,1% chất bảo quản ProClin300.

• Serum Diluent: 1 lọ, 11mL.Chứa muối đệm và thuốc nhuộm

• Dung dịch rửa Cô đặc, 1 lọ, 25 ml (đậm đặc 40 lần), dung dịch rửa PBS-Tween.

• Chất nền, 1 lọ, 11ml, sẵn sàng sử dụng, (tetramethylbenzidine) TMB.

• Dung dịch Dừng, 1 lọ, 6,0 ml axit sulfuric 1 mol / l.

• IFU, 1 bản sao.

• Tấm Nắp: 2 miếng.

Vật liệu bắt buộc (nhưng không được cung cấp)

• Đầu đọc vi sóng với khả năng hấp thụ bước sóng 450nm và 620nm.

• Máy giặt Microplate.

• Vườn ươm.

• Máy lắc tấm.

• Micropipet và micropipet đa kênh phân phối 50µl với độ chính xác tốt hơn 1,5%.

• Giấy thấm.

• Nước cất

5. Quy trình kiểm tra

• Chỉ sử dụng số lượng giếng cần thiết và định dạng các giếng vi tấm cho mỗi mẫu hiệu chuẩn và mẫu cần thử nghiệm.

• Thêm 100 µL chất hiệu chuẩn vào mỗi giếng.

• Thêm 100 µL Chất pha loãng Mẫu (Màu xanh lục) vào mỗi giếng Ngoại trừ các giếng Hiệu chuẩn.

• Thêm 10 µL Mẫu vào mỗi giếng Dịch pha loãng Mẫu (LƯU Ý: Thuốc thử trong Giếng sẽ chuyển từ màu Xanh lam từ Xanh lục), sau đó lắc 30 giây.

• Đậy nắp đĩa lại và ủ ở 37 ° C trong 30 phút.

• Loại bỏ các thành phần bên trong đĩa vi mô bằng cách gạn hoặc hút.Nếu gạn, hãy dùng giấy thấm để thấm khô đĩa.

• Thêm 350 µL dung dịch rửa, gạn (vòi và thấm) hoặc hút.Lặp lại 4 lần bổ sung cho tổng số 5 lần giặt.Khi kết thúc quá trình rửa, lật ngược đĩa và đổ hết dung dịch rửa còn sót lại lên giấy thấm.

• Thêm 100 µL liên hợp enzyme,

• Đậy nắp đĩa lại và ủ ở 37 ° C trong 30 phút.

• Thêm 350 µL dung dịch rửa, gạn (vòi và thấm) hoặc hút.Lặp lại 4 lần bổ sung cho tổng số 5 lần giặt.Khi kết thúc quá trình rửa, lật ngược đĩa và đổ hết dung dịch rửa còn sót lại lên giấy thấm.

• Thêm 100 µL Chất nền vào mỗi giếng.Đậy nắp và ủ ở nhiệt độ môi trường (18-25 ℃) trong bóng tối để phản ứng trong 10 phút.Không lắc đĩa sau khi thêm chất nền.

• Thêm 50 µL dung dịch dừng vào mỗi giếng.

• Lắc trong 15-20 giây để trộn chất lỏng trong giếng.Điều quan trọng là phải đảm bảo rằng màu xanh lam chuyển thành màu vàng hoàn toàn.

• Đọc độ hấp thụ của mỗi giếng ở bước sóng 450 nm (sử dụng 620 đến 630 nm làm bước sóng chuẩn để giảm thiểu sự không hoàn hảo của giếng) trong máy đọc đĩa vi mô.Kết quả phải được đọc trong vòng 30 phút sau khi thêm dung dịch dừng.